空氣微生物可以吸附在細(xì)小的顆粒物表面，從而較長(zhǎng)時(shí)間停留在空中，形成灰霾天氣。到目前為止，空氣微生物的研究已有約180 年的歷史［9］。1983 年，Jones 等［10］發(fā)現(xiàn)空氣微生物能夠?qū)е氯祟悺?dòng)物和植物疾病的傳播，威脅人健康。1997 年，F(xiàn)uzzi 等［11］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了空氣微生物具有代謝活性。在國(guó)內(nèi)，謝淑敏［12］和張素琴［13］等基于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法對(duì)京津地區(qū)的空氣微生物進(jìn)行了初步研究。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，其通量大、速度快等優(yōu)點(diǎn)，顯著提高了空氣微生物的研究深度。2009 年，Bowers 等［14］首次利用454 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)美國(guó)科羅拉多西北部一個(gè)高海拔地點(diǎn)的空氣微生物群落進(jìn)行了研究。細(xì)菌是空氣微生物的主要組成部分，在空氣中廣泛存在且豐度高［15-16］，其中，少部分細(xì)菌是潛在致病菌，是造成醫(yī)院感染的重要因素［17］，成為空氣微生物研究的焦點(diǎn)。因此，本文綜述空氣微生物的采樣方法和群落解析方法，并對(duì)其中細(xì)菌群落的研究進(jìn)展進(jìn)行重點(diǎn)綜述，以期為空氣微生物污染的控制及有針對(duì)性地制定相關(guān)治理措施提供論依據(jù)。1 空氣微生物的采樣方法微生物采樣方法的選擇是研究空氣微生物群落的第一步。目前，關(guān)于空氣微生物的采樣并沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。空氣微生物的采樣方法較多，不同采樣器各具優(yōu)缺點(diǎn)，主要依據(jù)研目的選擇合適的采樣方法。除此之外，在選擇采樣器的候還需考慮以下關(guān)鍵因素，如采樣效率、采樣靈敏度、操作的方便性、微生物的存活率、不同粒徑的區(qū)分及價(jià)格等。總的來(lái)說(shuō)，空氣微生物的采樣可以分為四大類，即慣性撞擊類、過(guò)濾阻留類、靜電沉著類和溫差迫降類，其中前兩類用的較多［18-20］。圖1 空氣微生物采樣方法Fig． 1 Sampling methods f airborne microorganisms圖1 對(duì)不同采樣方式的特點(diǎn)進(jìn)行了比較［18-20］。慣性撞擊類主要分為自然沉降法、射流撞擊式采樣和離心撞擊式采樣。其中，自然沉降法是最簡(jiǎn)單、成本低的方法，主要利用重力沉降的作用收集空氣微生物顆粒，但是由于空氣流量未知，不能用于定量測(cè)定。射流撞擊式采樣器，可分為固體撞擊式采樣器和液體撞擊式采樣器。這類采樣器主要利用抽氣裝置以恒定的空氣流量采集顆粒物，可以用于空氣微生物的定量測(cè)定。固體撞擊式采樣器流量的變化范圍為10 ～ 700 L/min;而液體撞擊式采樣器的流量較小，一般在12 ～ 20 L/min，其用于高濃度的空氣微生物采樣，可測(cè)定空氣中活性微生物的數(shù)量，但是不適于低溫和長(zhǎng)時(shí)間采樣。離心撞擊式采樣器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、體積小，對(duì)于細(xì)菌、真菌和病毒的捕獲效率較高，但其有效采氣量未知，也不能用作定量測(cè)定。過(guò)濾阻留類采樣利用抽氣裝置，使空氣微生物顆粒被截留在不同的濾材上，可以分為深層過(guò)濾和膜式過(guò)濾兩類，前者的濾材為纖維型或顆粒型濾料，后者是可溶性或不溶性的濾膜。這類采樣器可在低溫下進(jìn)行采樣，采集效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)其基本原理是通過(guò)將空氣微生物采集到特定的采樣介質(zhì)上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)繁殖生長(zhǎng)成菌落后計(jì)數(shù)，然后進(jìn)行分離和純化，結(jié)合微生的形態(tài)構(gòu)成、生理生化特征等實(shí)現(xiàn)對(duì)物種的分類鑒定［22］。在早期的研究中，國(guó)外一些研究學(xué)者使用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法研究空氣微生物，如Lindemann［23］、Lighthart［24Shaffer［25］等。20世紀(jì)90 年代，國(guó)內(nèi)相關(guān)研究逐漸興起，相關(guān)的研究人員有胡慶軒［26］、方志國(guó)［27］、謝淑敏［12］、凌琪［28］等。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法對(duì)于空氣微生物的研究是一個(gè)很好的方法，夠?yàn)槭澜绶秶鷥?nèi)空氣微生物基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的儲(chǔ)備提供基礎(chǔ)。同時(shí)，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法可以用來(lái)分離微生物菌株，是研究細(xì)菌生理和代謝特性等方面信息的最直接有效的方法［19，21，29-30］。但是，由于活的可培養(yǎng)的微生物占所有微生物的比例不超過(guò)1%［29］，大部分微生物是不能被培養(yǎng)的，采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法得到的微生物群落分布的信息極其有限，常會(huì)低估空氣微生物的多樣性，導(dǎo)致大量重要微生物被忽略或遺漏。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法相比，非培養(yǎng)的方法基于基因組DNA，能夠較全面分析空氣微生物的群落組成，提高了研究的廣度和深度。隨著研究的深入，非培養(yǎng)的方法分為傳統(tǒng)的分子物學(xué)技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)兩大類。傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( Polymerase Chain Reaction，PCR) ［31］、變性梯度凝膠電泳技術(shù)( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE) ［31］、末端限制性酶切片長(zhǎng)度多態(tài)性分析( Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T －RFLP) ［32］和克隆( Clone) 文庫(kù)［33］等。近年來(lái)，這些技術(shù)已越來(lái)越多用于空氣微生物多樣性的研究中。Li 等［34］利用PCR－ DGGE 研究了近地面和高海拔采集的TSP 樣品中細(xì)菌群落的差異。Lee 等［32］利用T － RFLP 對(duì)首爾空氣中細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。Jeon 等［35］利用克隆和DGGE 手段研究了亞洲沙塵對(duì)于空氣細(xì)菌群落的影響。但是，這些技術(shù)流程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，通量低，測(cè)序成本高，在研究空氣微生群落方面存在一定的局限性。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，大大高了環(huán)境微生物研究的深度。該技術(shù)具有數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高、價(jià)格便宜、速度快等特點(diǎn)［36］。目前，高通量測(cè)序技術(shù)以Roche公司的454、Illumina公司的Solexa 和Life Technologies 公司的SOLiD、Ion Torrent等為主［36］。454 測(cè)序是以DNA 乳膠擴(kuò)增系統(tǒng)和焦磷酸為測(cè)序的基礎(chǔ)，因此，也被稱為“焦磷酸測(cè)序”［36］。Illunima 公司的HiSeq 和MiSeq 測(cè)序平臺(tái)是基于Solexa 技術(shù)開發(fā)的，其特有的可逆終止子設(shè)計(jì)，減少了堿基的重復(fù)摻入，保證了測(cè)序的準(zhǔn)確性［36］。目前，454 和Illumina 測(cè)序技術(shù)在研究空氣微生物群落組成方面的應(yīng)用最為廣泛。Bowers 等［37］利用454 測(cè)序技術(shù)對(duì)美國(guó)中西部4 個(gè)城市夏季和冬季近地面PM2. 5樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。Robertson 等［38］利用454 測(cè)序技術(shù)對(duì)美國(guó)紐約城市地鐵中的生物氣溶膠的微生物群落進(jìn)行了研究。Bertolini 等［39］采用Illumina 測(cè)序技術(shù)研究了意大利米蘭城區(qū)交通密集區(qū)附近TSP 樣品中的空氣微生物分布。Mazar 等［40］利用Illumina 測(cè)序技術(shù)研究了地中海東部沙塵過(guò)程對(duì)于PM10中微生物群落的影響。此外，近年來(lái)的宏基因測(cè)序技術(shù)和基因芯片技術(shù)也被用來(lái)研究空氣微生物的群落組成［21，41］。3菌Bacillus) ，葡萄球菌屬( Staphylococcus) 和假單胞菌屬( Pseudomonas) 是優(yōu)勢(shì)屬。此外，微小桿菌屬Exiguobacterium和鏈霉菌屬( Streptomyces) 在珠江三角洲城市空氣中被檢測(cè)到，奈瑟氏菌屬( Neisseria meningitides也是上海城區(qū)的空氣微生物中的優(yōu)勢(shì)屬。這些研究表明，70% ～ 90%的細(xì)菌都屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，與國(guó)外的一些研究相一致［45-46］。但是，Diiorgio 等［47］研究表明，基于培養(yǎng)方法得到的細(xì)菌其中60%以上為革蘭氏陰性菌，與大部分研究結(jié)果不同。大部分研究結(jié)果都表明革蘭氏陽(yáng)性菌是空氣中主要的細(xì)菌，主要是由于它們的孢子對(duì)于大氣環(huán)境中的高太陽(yáng)輻射和干燥等惡劣環(huán)境的耐受性更強(qiáng)［19］。總的來(lái)說(shuō)，由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法本身的局限性，相應(yīng)的研究結(jié)果可能存在很大偏差。3. 2 基于高通量測(cè)序技術(shù)高通量測(cè)序技術(shù)的通量大，可以檢測(cè)到豐度極低的微生物，明顯提高了空氣細(xì)菌的研究深度。表2 對(duì)近年來(lái)基于高通量測(cè)序技術(shù)的空氣微生物群落的一些重要研究進(jìn)行了總結(jié)。由于樣品采集方法、群落解析手段及統(tǒng)計(jì)方法不同，導(dǎo)致不同研究結(jié)果的可比性較差，需要對(duì)不同研究進(jìn)行分類比較。目前，關(guān)于空氣細(xì)菌的研究主要集中于以下4 個(gè)方面: 1) 空氣細(xì)菌群落的空間和時(shí)間變化; 2 ) 特殊事件對(duì)空氣細(xì)菌的影響; 3) 探究空氣細(xì)菌的主要來(lái)源; 4 )環(huán)境變量和氣象因素與空氣微生物群落的關(guān)系，下別進(jìn)行綜述。表2 基于高通量測(cè)序技術(shù)的空氣細(xì)菌的群落組成Table 2 Airborne bacterial communities based on high-throughput sequencing2018 年2 月樊曉燕，等: 空氣微生物群落樣品采集、解析方法及研究進(jìn)展Feb． ，20183. 2. 1 空氣細(xì)菌群落的空間和時(shí)間變化從表2 可以看出，前人主要利用454 和Illumina 技術(shù)研究了不同城市( 如美國(guó)中西部、意大利米蘭和香港等) 、不同季節(jié)、不同粒徑顆粒( PM2. 5、PM10或TSP) 、不同地理利用類型、不同海拔高度空氣中細(xì)菌的群落組成。不同地點(diǎn)、不能海拔高度、不同土地利用類型空氣中細(xì)菌的主要組成相近，其中，變形菌門( Proteobacteria) 、放線菌門( Actinobacteria) 、擬桿菌門( Bacteroidetes) 、厚壁菌門( Firmicutes) 門( Cyanobacteria)是空氣細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)門［14，37-38，48-49，51-52］。這些細(xì)菌大都屬于革蘭氏陰性菌，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的革蘭氏陽(yáng)性菌結(jié)果完全不同。但是，Bowers 等［49］的研究也表明，空氣細(xì)菌群落與不同地點(diǎn)土地利用方式明顯相關(guān)，放線菌門( Actinobacteria) 是農(nóng)田和郊區(qū)的優(yōu)勢(shì)門，而根瘤菌目( Rhizobiales) 是森林的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。造成這種差異主要是由于不同利用方式下細(xì)菌來(lái)源不同，采樣期間細(xì)菌的來(lái)源直接決定了空氣中細(xì)菌群落的多樣性，這與Bertolini 等［39］的研究結(jié)果一致。此外，空氣細(xì)菌存在一定的季節(jié)變化。Bowers 等［37］研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門是夏季細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)門，而厚壁菌門和梭桿菌門( Fusobacteria)是冬季細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)門。在目水平上，Pseudomonadales)、伯克氏菌目( Burkholderiales) 、根瘤菌目Rhizobiales)和鞘脂單胞菌目( Sphingomonadales) 是夏季的主要細(xì)菌，而擬桿菌目( Bacteroidales) 和Clostridiales) 是冬季優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。3. 2. 2 特殊事件對(duì)空氣細(xì)菌群落的影響對(duì)于特殊事件，如霧霾過(guò)程和沙塵過(guò)程中空氣細(xì)菌群落的研究及其與非霾天和非塵天氣的差異也是研究的重點(diǎn)，對(duì)于探究霧霾和沙塵天氣的形成機(jī)理及評(píng)估其影響，具有重要意義。Cao 等［21］在霧霾天氣利用宏基因組研究了PM2. 5和PM10中微生物的種群分布特征。研究表明，細(xì)菌群落組成在霧霾過(guò)程中并未發(fā)生明顯的變化，放線菌門( Actinobacteria) 、變形菌門( Proteobacteria) 、綠彎菌門( Chloroflexi) 、厚壁菌門( Firmicutes) 和擬桿菌門( Bacteroidetes) 是主要的細(xì)菌門。但是，該研究中發(fā)現(xiàn)了一些潛在致病菌，其相對(duì)豐度在整個(gè)霧霾過(guò)程中發(fā)生了變化。例如，發(fā)現(xiàn)的肺炎鏈球菌，是引發(fā)社區(qū)得性肺炎的常見菌種，其在PM2. 5和PM10中所占的比例分別為0. 012%和0. 017%，隨污染過(guò)程加重，其比例不斷升高，從0. 024%增加為0. 050%。空氣細(xì)菌群落在沙塵過(guò)程中發(fā)生了明顯變化。Mazar等［40］研究了地中海東部沙塵過(guò)程細(xì)菌群落的變化，發(fā)現(xiàn)芽單胞菌門( Gemmatimonadetes) 、紅桿菌綱( Rubrobacteria) 、弗蘭克氏( Frankiaceae) 和魚孢菌科( Sporichthyaceae) 是沙塵天氣的主要細(xì)菌，而在非沙塵天氣，細(xì)菌主要屬于皮菌科Dermabacteraceae) 和乳桿菌科( Lactobacillaceae) 。Polymenakou等［53］對(duì)克里特島( 希臘) 沙塵事件中空氣細(xì)菌組成的研究發(fā)現(xiàn)，在粗粒子中，細(xì)菌主要屬于厚壁菌門( Firmicutes) ，而在細(xì)粒子中，其逐漸被放線菌門( Actinobacteria) 所替代。Jeon等［54］的結(jié)果表明沙塵天和非沙塵天空氣細(xì)菌組成存在明顯的差異。沙塵天氣，厚壁菌門( Firmicutes) 是細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)門，在總序列中的占比高達(dá)53%，而在非沙塵天氣，細(xì)菌主要屬于變形菌門( Proteobacteria) 。3. 2. 3 空氣細(xì)菌的主要來(lái)源究空氣中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)還可以用來(lái)預(yù)測(cè)空氣細(xì)菌的來(lái)源。前人的一些研究表明: 顆粒物中豐度最高的微生物可以作為推測(cè)空氣細(xì)菌來(lái)源的指示，并通過(guò)這些指示微生物來(lái)考察不同來(lái)源的相對(duì)貢獻(xiàn)［39］。但是，在細(xì)菌溯源分析中，是否將葉綠體( Chloroplast) 序列包含在序列分析中，依然是一個(gè)有爭(zhēng)議的問(wèn)題。由于葉綠體16S rRNA 基因與細(xì)菌16S rRNA基因有一定的重合，其在高通量測(cè)序中會(huì)占據(jù)一定的比例。Brodie［55］、Fahlgren［56］、Franzetti［50］和Bertolini［39］等把葉綠體序列包含在內(nèi)，主要是由于植物是空氣生物的主要來(lái)源，包含葉綠體序列對(duì)于探究空氣微生物來(lái)源具有一定的幫助。而其他一些研究，如Jeon［54］和Maron［57］等將葉綠體序列排除在外，因?yàn)槿~綠體畢竟不是細(xì)菌的組成部分。Bertolini 等［39］從米蘭采集40 個(gè)顆粒物樣品，并用Illumina進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明，土壤和植物是空氣細(xì)菌微生物群落的主要來(lái)源。Bowers 等［49］的研究表明，土壤和植物落葉是空氣細(xì)菌的主要來(lái)源。除了土壤和植物外，動(dòng)物糞便，尤其是狗的糞便，也是PM2. 5樣品中細(xì)菌的主要來(lái)源［37］。在大陸和溫帶地區(qū)，不同的研究都表明，植物是空氣細(xì)菌的主要來(lái)源，尤其是在溫暖的季節(jié)。Fahlgren 等［56］的研究結(jié)果表明，在溫暖季節(jié)，植物相關(guān)的細(xì)菌及葉綠體的序列在總序列中所占的比例極高，而在寒冷季節(jié)，空氣細(xì)菌只要是一些土壤相關(guān)的細(xì)菌。此外，還可以通過(guò)后向軌跡來(lái)分析空氣細(xì)菌的來(lái)源。3. 2. 4 環(huán)境變量和氣象因素與空氣微生物群落的關(guān)系空氣微生物學(xué)的另一大目標(biāo)是研究影響空氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子和氣象條件。目前，只有極少數(shù)研究考察了單一氣象因子的影響［52，55，58］。空氣溫度是影響不同環(huán)境微生物群落的重要影響因子。Maron 等［58］研究結(jié)果表明，溫度和相對(duì)濕度對(duì)于法國(guó)南錫城市空氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)季節(jié)變化的貢獻(xiàn)最大。Bowers 等［52］研究結(jié)果表明，溫度是空氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的唯一影響因素，尤其對(duì)于春季和秋季季節(jié)間的變化的影響最大。此外，許多研究結(jié)果也表明，空氣細(xì)菌群落的空間時(shí)間變化主要是由其他一些環(huán)境變量引起的，如氣象因子( 除溫度外) 、顆粒物中的化學(xué)成和空氣微生物的主要來(lái)源［55］。因此，環(huán)境因子與空氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系依然不清楚，還有待進(jìn)一步研究。3. 3 展望針對(duì)目前研究中存在的不足，空氣微生物未來(lái)可深入研究的有以下幾方面。1) 統(tǒng)一采樣標(biāo)準(zhǔn)，開發(fā)更高效合理的空氣微生物采樣器，使采樣更能反映原位狀態(tài)。2) 完善空氣微生物基因組DNA 提取的方法，為后續(xù)群落鑒定提供保障。3) 空氣微生物的空間和時(shí)間變化研究。擴(kuò)大空氣微生物研究范圍，如全國(guó)范圍、城市站和背景站的對(duì)比研究、不同生態(tài)功能的空氣微生物的研究等; 考察空氣微生物長(zhǎng)時(shí)間( 如5 a、10 a) 變化規(guī)律。4) 加強(qiáng)特殊污染事件中空氣微生物的研究，探究霧霾形成的生物學(xué)機(jī)理，有針對(duì)性的提出治理措施。同時(shí)，有必要開展霧霾過(guò)程中潛在致病菌的研究，對(duì)于評(píng)估污染過(guò)程對(duì)于人體健康的影響具有重要作用。5) 進(jìn)一步探討空氣微生物與環(huán)境因子，如溫度、相對(duì)濕度、風(fēng)速、PM2. 5及其中物理化學(xué)成分和氣態(tài)污染物之間的內(nèi)在聯(lián)系，初步確定空氣微生物污染的形成機(jī)制。360Vol． 18 No． 1 安全與環(huán)境學(xué)報(bào)第18 卷第1 期6) 空氣微生物的粒徑布特征尚不清楚，有必要通過(guò)多級(jí)采樣器，采集分級(jí)顆粒物，系統(tǒng)研究微生物的粒徑分布特征，有利于全面評(píng)估其對(duì)人體健康的危害。4 結(jié)論空氣微生物能夠?qū)е氯祟惣皠?dòng)植物疾病的傳播、工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的腐爛變質(zhì)，影響人體健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。嚴(yán)重霧霾的快速形成和擴(kuò)散與其中微生物的快速繁殖密切相關(guān)，研究空氣微生物具有重要的意義。目前，相關(guān)研究還處于剛剛起步階段，仍存在許多問(wèn)題: 1) 采樣技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，常用的采樣技術(shù)，雖對(duì)顆粒物的捕獲效率高，但在反映其原始狀態(tài)上存在一定缺陷; 2) 采集的顆粒物質(zhì)量較少，很難從其中提取高質(zhì)量、高濃度的DNA 樣品，在一定程度上限制了后續(xù)微生物分析的準(zhǔn)確性; 3) 空氣微生物的研究主要集中于城市地區(qū)，研究面太窄; 4) 空氣微生物時(shí)間上的變化大多關(guān)注于其季節(jié)變化; 5) 特殊污染事件中空氣微生物的研究有待進(jìn)一步加強(qiáng);6) 空氣微生物與環(huán)境因子之間的關(guān)系仍不清楚。

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