細胞培養基 Dulbecco 改良的Eagle 培養基（Dulbecco modified Eaglemedium，DMEM）、血清、碳酸氫鈉和青鏈霉素購自美國 Invitrogen 公司；dNTP 和 Taq 酶購自日本 TaKaRa 公司；Hank 液購自美國 Hyclone 公司。PTC-200PCR 儀為美國Bio-Rad 公司產品；miniMAG 自動核酸提取儀為法國生物梅里埃公司產品；NU-4750E 細胞培養箱、NU-425-400E IIA2型生物安全柜為美國 Nuaire 公司產品；ECLIPSE80i 熒光顯微鏡為日本 Nikon 公司產品；二級安德森微生物氣溶膠采樣器由遼陽市應用技術研究所提供；DV40 型全玻璃直角氣溶膠發生器由北京比賽福生物安全技術有限公司提供。 氣溶膠主動發生的模擬 在生物安全柜正常運轉情況下，在柜內將 10 ml rAdvGFP 病毒液置于 DV40 全玻璃直角氣溶膠發生器內。發生器和安德森采樣器的擺放位置如圖 1A，發生器管口距離安全柜臺面約 12 cm。分別在距離發生器管口 0、10 和 20 cm 處的安全柜臺面上放置采樣器和培養皿，用于病毒氣溶膠和沉降病毒顆粒的采集。采樣器分上下兩層，其采樣撞擊孔孔徑分別為 0.5 和0.2 μm，內置培養皿，在每組采樣器的內側平行位置放置 3 個培養皿，每個培養皿內放置 5 ml 采集液，在氣溶膠發生 30 s 后，計時連續采集 5 min，收集各采樣器及培養皿中的液體進行檢測。1.2.2 吹打及振蕩模擬試驗 將 10 ml 病毒液置于 50 ml 離心管中，離心管距離安全柜操作臺面約12 cm。在模擬吹打的操作中，用微量移液器反復吸取吹打病毒液，期間避免病毒液溢灑和噴濺；在模擬振蕩操作中，將 10 ml 病毒液置于 50 ml 離心管中，用振蕩器的最大速度渦旋振蕩病毒液1 min 后立即打開管蓋采集 2 min，然后蓋緊再次震蕩 30 s 后開蓋繼續采集，模擬振蕩的操作見圖 2A。兩組模擬操作中，均在距離離心管管口0 和 10 cm處的安全柜臺面上放置采樣器，在采樣器的內側平行位置放置培養皿進行病毒的采集，均采集 5 min 后收集各采樣器及培養皿中的采集液進行檢測。1.2.3 病毒濃縮 將采樣器和培養皿中的采集液收集到 15 ml 離心管中，加入終濃度為 400 μg/μl的陽離子多聚物聚凝胺（polybrene，PB），置 37 ℃孵育 30 min，于室溫 2300 × g 離心 40 min 后棄上清，懸于 800 μl 不含血清的 DMEM 孵育液，得到濃縮后樣本。取濃縮后的樣本 200 μl 接種至24 孔板上培養單層的人胚腎 293 細胞（8 × 104 細胞/孔），每個樣本接種 2 孔，700 × g 室溫低速離心 45 min，在 37 ℃、5% CO2 培養箱中孵育 1 h后棄去孵育液，更換含 2% 胎牛血清的 DMEM培養液繼續培養 48 h 后，在熒光顯微鏡下觀察GFP 熒光。對未見明顯 GFP 熒光出現的樣本連續培養 3 代，培養 3 代后仍未見 GFP 熒光的則認為病毒未復制。所有試驗均重復 3 次。1 . 2 . 4 PCR 檢測 取 200 μ l 濃縮樣本用miniMAG 自動核酸提取儀提取病毒核酸，用腺病毒特異性引物進行 PCR 檢測。腺病毒檢測引物序列分別是上游 AdVF：5’ GCCSCARTGGKCWTACATGCACATC 3’；下游 AdVR：5’ CAGCACSCCICGRATGTCAAA 3’[7]。PCR 反應體系，10 × 緩沖液2 μl、10 mmol/L 的 dNTP 0.4 μl、50 μmol/L 上、下游引物各 0.3 μl、5 U/μl 的 Taq DNA 聚合酶0.2 μl、滅菌雙蒸水 14.8 μl、核酸 2 μl，總體積為20 μl。PCR 反應程序為：94 ℃ 預變性 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環；72 ℃延伸 10 min。反應結束后取 5 μl 擴增產物進行2% 瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增目的片段大小為301 bp。為了評價安德森采樣器的采樣效率以建立方便的病毒氣溶膠采集體系，首先用氣溶膠發生器模擬病毒氣溶膠的主動發生，將采樣器和采集沉降病毒的平行放置培養皿中的采集液經 PB 濃縮后，進行核酸檢測和接種 293 細胞，觀察病毒的復制。在距離發生器管口 0 和 10 cm 處放置的各培養皿和采樣器以及在距發生器管口 20 cm 處放置的培養皿和采樣器 2 中均檢測到病毒核酸，但置于20 cm 處的采樣器 1 未檢測到病毒核酸。用上述樣本接種 293 細胞，在培養 48 h 后均可在熒光顯微鏡下觀察到細胞中的綠色熒光。這些結果表明，在距離發生器管口 0、10 和 20 cm 處放置的不同孔徑的采樣器中均可采集到病毒氣溶膠（圖 1B、1C）。